Mengapa perlu dilakukan pengenceran bertingkat dalam mengisolasi mikroba?

You're Reading a Free Preview
Pages 6 to 10 are not shown in this preview.

Menurut (Wasteson and Hornes, 2009) tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan.

Apa yang dimaksud dengan teknik pengenceran?

Pengenceran adalah melarutkan atau melepasan mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. -Tujuan dari teknik ini adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya.

Apa yang dimaksud pengenceran larutan?

Jawaban: Pengenceran yaitu suatu cara atau metode yang diterapkan pada suatu senyawa dengan jalan menambahkan pelarut yang bersifat netral, lazim dipakai yaitu aquadest dalam jumlah tertentu.

Mengapa bakteri harus dihitung?

Perhitungan jumlah bakteri merupakan salah satu cara yang dilakukan untuk bisa mengetahui berapa banyak koloni bakteri yang terdapat pada suatu media, baik itu koloni sel yang hidup maupun koloni sel bakteri yang mati.

b. Teknik Serial Dilution (Pengenceran bertingkat/berseri) Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan.

Mengapa tabung reaksi harus dibungkus dengan aluminium foil?

Bagian luar tabung reaksi kemudian dibungkus dengan aluminium foil agar tidak ditumbuhi cendawan.

Apa fungsi media dalam mikrobiologi?

Media adalah campuran nutrien atau zat makanan yang dibutuhkan oleh mikroorganisme untuk pertumbuhan. Media selain untuk menumbuhkan mikroba juga dibutuhkan untuk isolasi & inokulasi mikroba serta untuk uji fisiologi dan biokimia mikroba.

Apa fungsi agar pada media biakan mikroba?

Agar digunakan sebagai bahan pemadat karena tidak menguraikan mikroorganisme, dan membeku pada suhu diatas 45oC. Kandungan agar sebagai media pemadat dalam media sekitar 1.5–2% (Bibiana, 1994).

Mengapa sebelum perhitungan jumlah mikroba suspensi mikroba harus diencerkan?

Suspensi bakteri uji diencerkan dari 10-1 sampai 10-7, tujuan dari pengenceran bertingkat ini untuk mengurangi jumlah mikroba dalam cairan memudahkan dalam melakukan perhitungan. Penentuan tingkat pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba yang ada pada sampel.

Aluminium foil untuk apa?

Kegunaan Aluminium Foil untuk Makanan Namun, bukan hanya sebagai pembungkus makanan biasa, aluminium foil juga bisa dimanfaatkan untuk memasak dan menyimpan makanan agar kualitasnya tahan lebih lama. Dalam kegiatan memasak, aluminium foil umumnya digunakan untuk membukus makanan yang akan dipanggang atau dibakar.

Berapa suhu inkubasi?

Dalam pembahasan alat inkubator bakteri penulis membatasi pokok- pokok batasan yang akan dibahas, yaitu: 1. Proses inkubasi hanya menggunakan suhu 37 derajat celcius.

Apa yang dimaksud dengan inkubasi?

Pengertian Inkubasi ialah proses menjaga dan merawat sesuatu hal dalam kondisi tertentu dengan tujuan agar sesuatu hal tersebut dapat berkembang dan menghasilkan dengan baik sesuai harapan.

Apa yang dimaksud dengan proses inkubasi?

Kata inkubasi (dari bahasa Latin incubare, “berada di atas”) bisa merujuk ke: Inkubasi burung, di mana burung mengerami telur untuk menetaskannya. Masa inkubasi, istilah kedokteran untuk waktu antara terpajan infeksi dan menunjukkan gejala awal.

Pengenceran bertingkat adalah tahap analisis laboratorium yang berfungsi untuk mengencerkan jumlah mikroorganisme di dalam sampel (jika diperkirakan sangat padat) dengan perbandingan pengenceran 1:9 sehingga diperoleh pengenceran 1/10 untuk setiap tingkat pengencerannya. Perbandingan lain juga dapat diaplikasikan, misalnya 1:2 atau 1:5.

Pengenceran pertama (Initial suspension/primary dilution) adalah suspensi, larutan atau emulsi yang diperoleh setelah menimbang atau mengukur kuantitas suatu produk sebelum diuji (atau sampel uji yang dipersiapkan dari produk) yang telah dicampur dengan pengencer sebanyak sembilan kali lipatnya sehingga jika terdapat partikel besar dapat terendapkan. Sedangkan pengenceran bertingkat selanjutnya (further decimal dilution) adalah suspensi atau larutan yang diperoleh dengan mencampur volume yang terukur dari pengenceran pertama dengan volume sembilan kali lipatnya dan dengan mengulangi cara ini dengan pengenceran desimal selanjutnya sampai diperoleh pengenceran yang cocok untuk inokulasi (ISO 6887-1, 1999, hal. 1).

1. Pemilihan Larutan Pengencer

Berbagai cairan pengencer dapat dijumpai pada Tabel 1. Diluent ini dapat dengan bebas dipilih sesuai kegunaannya. Namun jika metode yang dirujuk menyebutkan nama cairan pengencer tertentu maka sebaiknya tetap memakai cairan pengencer tersebut.

Tabel 1. Berbagai larutan pengencer yang dapat dipilih untuk digunakan dalam pengenceran bertingkat. Diolah dari ISO 6887-1 (1999);6887-2 (2003); ISO 8199 (2005); AOAC OM 966.23 (2005).

ISO 8199 (2005) menyatakan bahwa cairan pengencer dapat disimpan pada suhu 5±3 °C selama maksimum 6 bulan dan dapat dibagikan ke tabung atau botol setelah atau sebelum sterilisasi (hal. 2-4).

King dan Hurst (1963) melaporkan bahwa larutan pengencer yang paling baik adalah 0,1 % peptone solution. Sedangkan larutan air + 0,1 % Na2S2O3 menghasilkan data yang lebih tidak memuaskan. Namun larutan quarter–strength ringer solution, 0,85% NaCl dan air destilasi menunjukkan sifat bakterisidal kepada satu atau lebih dari 4 spesies bakteri yang diuji (hal. 504). Sedangkan McFetters et al. (1982) juga menunjukkan bahwa larutan peptone water dan phosphate buffer + 0,1 % peptone adalah pengencer yang paling stabil dibandingkan yang lain yaitu mampu menghasilkan recovery antara 80-90 % untuk jenis Coliform (hal. 99), seperti yang ditunjukkan pada Grafik 1. Straka dan Stokes (1956) juga merekomendasikan 0,1 % peptone sebagai larutan pengencer untuk mempertahankan bakteri paling tidak selama 1 jam karena telah membuktikan bahwa air destilasi akan mengurangi 90 % jumlah bakteri dalam 1 jam dan phosphate water juga dapat mematikan 80 % dalam waktu yang sama (hal. 24). Oleh karena itu, dari beberapa studi diatas (jika tidak mengikuti syarat metode baku terkait) perlu dipertimbangkan menggunakan larutan peptone 0,1 % atau yang mengandung peptone 0,1 % untuk menghasilkan larutan yang mampu mempertahankan bakteri hidup tanpa mereplikasinya dan memulihkan bakteri yang terluka.

Grafik 1. Pengaruh jenis larutan pengencer dan lama pemaparan pada recovery bakteri E.coli yang terluka (90%) dan tidak terluka pada suhu 24 °C. Diadaptasi dari” Influence of diluents, media, and membrane filters on detection of injured waterborne coliform bacteria.”, oleh McFetters et al., 1982, hal. 99.

2. Prosedur pengenceran

Cairan pengencer yang telah siap sebaiknya dibagikan ke dalam tabung atau labu berpenutup ulir dengan volume 9,0 mL setelah sterlisasi. Volume akhir ini harus tidak melebihi ±2 %. Pemindahan cairan saat pengenceran sebaiknya menggunakan pipet ukur 1 dan 10 mL dengan skala 0,1 mL dan 0,5 mL (ISO 6887-1, hal. 3-4). Air yang digunakan sebaiknya memiliki karakterstik sesuai dengan persyaratan pembuatan media.

ISO 6887-1 (1999) merekomendasikan tahap-tahap pengenceran yaitu :

Pengenceran pertama:

• Sampel ditimbang (m) atau diambil volume (V) di dalam plastik steril atau mangkuk steril dengan ketidakpastian ±5 %.
• Cairan pengencer sebanyak 9×m (g) atau 9×V (mL) ditambahkan pada sampel. Dapat dimungkinkan untuk menambahkan cairan pengencer lebih dari 1:9 jika larutan pada pengenceran pertama menunjukkan masih terlalu kental. Penambahan ini tentunya harus dimasukkan dalam perhitungan akhir. Selain itu, pengenceran pertama ini memiliki pengaruh terhadap LOD suatu metode dan juga tergantung pemilihan teknik inokulasi (spread plate atau pour plate). Jika diperlukan, cairan pengencer dapat ditambahkan dibawah ketentuan 1:9 yang berfungsi untuk meningkatkan batas pendeteksian tersebut. Volume diluent yang berbeda ini harus dilaporkan ke dalam laporan akhir.
• Pencegahan kerusakan mikroorgansime karena perubahan suhu yang mendadak dapat dihindari dengan mengaklimatisasi suhu pengencer ke dalam suhu ambien.
• Partikel sampel yang berukuran besar sebaiknya dibiarkan mengendap. Jika diperlukan dapat ditunggu sampai 15 menit.

Pengenceran bertingkat selanjutnya:

• 1 mL dari pengenceran pertama dipindahkan dengan pipet (ketidakpastian pengukuran ±5 %) ke dalam tabung yang mengandung 9 mL pengencer pada suhu yang sesuai. Jika diperlukan, volume yang dipindahkan dapat diperbesar dan dengan volume pengenceran selanjutnya sebanyak 9 kali lipatnya.
• Sebaiknya pipet jangan dimasukkan lebih dari 1 cm ke dalam pengencer pertama untuk mencapai presisi yang optimal dan dilakukan pencegahan kontak antara pipet yang mengandung inokulum dengan pengencer steril.
• Setelah dimasukkan, maka larutan dicampur menggunakan stirrer mekanik (vortex) selama 5-10 detik untuk mendapatkan pengenceran 1/100. Jika diperlukan cara ini dapat diulangi sampai mendapatkan tingkat pengenceran yang sesuai.

Waktu yang diperlukan untuk mengerjakan tahap persiapan pengenceran pertama sampai diinokulasikan ke medium sebaiknya tidak melebihi 45 menit. Sedangkan waktu yang direkomendasikan untuk melakukan tahap pengenceran pertama sampai akhir pengenceran bertingkat adalah selama 30 menit. Jika suhu ambien di laboratorium cukup tinggi, maka batas waktu pengerjaan tersebut sebaiknya dipersingkat (hal. 4-5) (lihat Gambar 2). Pembatasan waktu pengenceran ini dilakukan untuk menjaga bakteri pada suspensi tidak bertambah dan tidak berkurang.

Gambar 2. Tahap-tahap proses pengenceran pada pengenceran pertama dan pengenceran selanjutnya berdasarkan interpretasi dari ISO 6887-1 (1999). Diambil dari dokumentasi pribadi.

Dapat digarisbawahi pada prosedur diatas bahwa disarankan untuk mengendapkan dahulu pengenceran pertama selama 15 menit yang berfungsi untuk memisahkan partikel besar sampel dengan larutan yang mengandung mikroorganisme. Setelah perlakuan pendiaman tersebut dimungkinkan sel mikroorganisme akan tetap terlarut di diluent sedangkan partikel sampel akan mengendap. Selain itu, fungsi lainnya adalah untuk menyadarkan (resuscitation) mikrob yang stress pada sampel dan menghilangkan busa yang terbentuk pada jenis sampel tertentu. Namun, terdapat pandangan lain dalam pengenceran ini, yaitu pengenceran pertama harus dikocok/dihomogenkan dahulu bersama partikel sampel sampai sesaat sebelum dipindahkan oleh pipet (tanpa didiamkan) untuk mendapatkan distribusi sampel yang seragam karena dimungkinkan terdapat mikroorganisme dalam partikel tersebut yang tidak terambil jika diendapkan. Jadi partikel sampel harus ikut terisap oleh pipet saat partikel tersebut berada dalam kondisi tersebar merata sebelum mengendap. Cara kedua ini lebih berisiko karena keberadaan partikel sampel dapat dimungkinkan menghambat pertumbuhan. Ilustrasi perbedaan ini dapat diperhatikan pada Gambar 3. Hartman dan Huntsberger (1961) menunjukkan tidak adanya perbedaan yang signifikan pada jumlah hitungan cawan total dengan penanaman 1, 2, 3, 4 dan 8 menit setelah proses homogenisasi dengan blender selama 2 menit. Sampel yang digunakan adalah pai ayam beku (hal. 36).

Gambar 3. Perbedaan perlakuan pengambilan homogenat pada pengenceran pertama untuk ditanam atau diencerkan lebih lanjut. Setelah partikel sampel didiamkan dan mengendap atau setelah partikel sampel dikocok dan masih tersebar. Titik putih adalah partikel sampel dan titik hitam adalah gambaran sel. Diambil dari dokumentasi pribadi.

Indra Pradhika, 2018

AOAC OM 17.2.01. 966.23 Microbiological methods, AOAC Official Method of Analysis Microbiological Methods (2005).

Hartman, P. A. & Huntsberger, D. V. (1961). Influence of subtle differences in plating procedure on bacterial counts of prepared frozen foods. Iowa agricultural and home economic experiment station, Journal paper no. J-3843 Vol. 9, 32-36. Abstrak diperoleh dari: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1057665/#

ISO 6887-1:1999 Microbiology of food and animal feeding stuffs – Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination – Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilution. (1999).

ISO 6887-2: 2003 Microbiology of food and animal feeding stuffs – Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination – Part 2: Spesific rules for the preparation of meat and meat product. (2003).

ISO 8199: 2005 Water quality — General guidelines on the enumeration of microorganisms by culture. (2005).

King, W. L., & Hurst, A. (1963). A note on the survival of some bacteria in different diluents. Journal of Applied Microbiology, Vol. 26, Iss. 3, 504-506. doi: 10.1111/j.1365-2672.1963.tb04803.x